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飼料添加腸膜蛋白對南美白對蝦生長性能、消化、免疫和應激反應的影響

飼料添加腸膜蛋白對南美白對蝦生長性能、消化、免疫和應激反應的影響

楊闖1,胥學新2,江生2,李珍2,曹小娟1,3,高堅[1],3

1華中農業大學水產學院,華中農業大學,武漢 430070;

2北京中科景明生物技術有限公司,北京 100193;

3華中農業大學水產養殖國家級實驗教學示范中心,華中農業大學,武漢 430070

要:本研究探討了飼料中添加腸膜蛋白對南美白對蝦(Litopenaeus vannamei)生長性能、消化、免疫和應激反應的影響。實驗設置四種配合飼料,以未添加腸膜蛋白作為對照組(0%),在飼料中分別添加2.5%、5%10%的腸膜蛋白,選擇初重約為0.21±0.01g的南美白對蝦,分別投喂四種配合飼料,每種飼料3個重復,分別在20d40d時,取樣統計生長性能,檢測相關消化酶和免疫酶活性,肝胰臟相關免疫基因mRNA的表達水平,并進行氨氮脅迫應激實驗。結果顯示:喂養20d時,5%組幼蝦末體重、增重率、特定生長率顯著高于其它組(P<0.05)。在肝胰臟中,5%組的堿性磷酸酶、總超氧化物歧化酶和脂肪酶酶活顯著高于其它組(P<0.05)。在氨氮應激48h后,發現5%組的存活率高于其它各組。腸膜蛋白組肝胰臟中proPOPE的表達量顯著高于對照組(P<0.05);喂養40 d的成蝦,同樣是5%組的末體重、增重率、特定生長率顯著高于其余各組(P<0.05)。酸性磷酸酶、總超氧化物歧化酶、溶菌酶和脂肪酶酶活5%組最高(P<0.05)。5%組的氨氮脅迫存活率高于0%、2.5%10%組。5%proPOPE的表達量顯著高于0%、2.5%10%(P<0.05)。綜上所述:南美白對蝦飼料中添加5%腸膜蛋白可改善南美白對蝦生長性能、消化酶活性及免疫應激水平。

關鍵詞:南美白對蝦;腸膜蛋白;生長;抗氧化性能。

腸膜蛋白作為一種新型功能營養性動物蛋白質原料,其蛋白含量高,富含豐富的小肽和游離氨基酸,是替代血漿蛋白粉、乳清粉、魚粉等昂貴蛋白原料的選擇之一[1]。 另外,腸膜蛋白可以提高抗病性,增強動物免疫力,提高消化道酶活性。高欣等[2]研究表明,添加腸膜蛋白能明顯提高斷奶仔豬(Susscrofa domestica)生長性能和降低腹瀉指數,且有提高消化道酶活性的趨勢。腸膜蛋白源于健康豬腸道上皮黏膜,是一種新型功能營養性動物蛋白質原料,不僅含有豐富的蛋白質、脂肪、纖維和磷、鈣、鉀等礦物質元素,還含有大量的小肽和游離氨基酸,且水溶性好,可以更易、更快的被機體吸收利用[3-6]。另外新的蛋白質營養理論中表明,小肽可以在動物消化道被完整的吸收[7]。在動物飼料中添加腸膜蛋白,不僅可以減少魚粉的用量,也可以有效的促進動物生長,提高飼料利用率。Myers[8]研究結果表明,飼喂腸膜蛋白粉能顯著地提高斷奶仔豬的平均日增重,降低料肉比。Rouchey[9]研究發現,對于20日齡斷奶仔豬,飼喂腸膜蛋白粉可以顯著提高平均日增重, 降低料肉比。要秀兵等[10]21日齡斷奶的PIC配套系五元雜交仔豬進行研究,發現添加腸膜蛋白組的平均日增重高于對照組, 而飼料增重比低于對照組。關于腸膜蛋白在水產動物飼料中的相關研究還鮮有報道。楊志強等[11]通過測定凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)對花生粕、玉米蛋白粉、羽毛粉、腸膜蛋白粉、雞肉粉、肉骨粉和噴霧干燥血粉粗蛋白和氨基酸的消化率,表明凡納濱對蝦對腸膜蛋白的粗蛋白消化率和氨基酸消化率最高。盡管腸膜蛋白在凡納濱對蝦的生長性能有著很好的添加效果,但關于凡納濱對蝦飼料腸膜蛋白的最適添加水平,及其對凡納濱對蝦的生長,消化吸收等生理指標的研究還未見報告。

南美白對蝦學名凡納濱對蝦,別名凡納對蝦、白腳蝦等,是當今世界養殖產量最高的三大蝦類之一[12]。南美白對蝦具有個體肥碩、肉質鮮嫩、營養豐富、營養需求低、生長快、出肉率高、抗病力強、適溫適鹽范圍廣等優點,現已成為我國對蝦養殖區的主要養殖品種[13]。然而,在南美白對蝦養殖過程中還存在眾多問題。例如:飼料中魚粉的大量使用、病害頻發、抗脅迫能力低等問題。因此,本實驗對不同生長階段南美白對蝦的生長性能、相關消化酶和免疫酶活性、氨氮脅迫存活率及免疫相關基因表達等方面綜合探討腸膜蛋白對魚粉的可替代性及適宜替代水平,旨在為南美白對蝦優化型飼料的研發、腸膜蛋白在南美白對蝦飼料中的添加效果提供基礎數據。

1    幼蝦實驗用飼料配方及營養組成

Tab. 1    Formula and nutrition composition of juvenile shrimp for experiment (%)

原料Ingredient

0%

2.5%

5%

10%

魚粉 Fish meal

磷蝦粉 Krill meal

豆粕 Soybean meal

糊精Dextrin

α淀粉 α-Starch

魚油 Fish oil

大豆卵磷脂 Soy lecithin

膽固醇 Cholesterol

高筋面粉 Bread flour

維生素混合物 Vitamin mixturea

礦物質混合物 Mineral mixtureb

安定-C35 Stability - C35

氯化膽堿 Choline chloride

檸檬酸鈉 Sodium citrate

琥珀酸鈉 Sodium succinate

氨基葡()糖鹽酸 Glucosamine hydrochloric acid

角叉菜膠 Carrageen glue

腸膜蛋白 Intestinal membrane protein

合計Total

營養水平 Proximate composition

粗蛋白 Crude protein

粗脂肪 Crude lipid

粗灰分 Ash

水分 Moisture

41.00

5.00

15.00

3.00

8.00

2.00

2.00

5.00

5.00

4.00

4.00

0.20

0.60

0.60

0.60

1.00

3.00

0.0

100.00

42.36

6.54

10.03

9.56

38.5

5.00

15.00

3.00

8.00

2.00

2.00

5.00

5.00

4.00

4.00

0.20

0.60

0.60

0.60

1.00

3.00

2.5

100.00

42.56

6.78

9.86

9.45

36.0

5.00

15.00

3.00

8.00

2.00

2.00

5.00

5.00

4.00

4.00

0.20

0.60

0.60

0.60

1.00

3.00

5.0

100.00

42.86

6.81

9.78

9.36

31.0

5.00

15.00

3.00

8.00

2.00

2.00

5.00

5.00

4.00

4.00

0.20

0.60

0.60

0.60

1.00

3.00

10.0

100.00

42.43

6.65

9.82

9.51

注:a礦物質預混料(mg/kg飼料): 硫酸鎂, 3380; 磷酸氫二鈉, 2153.33; 磷酸氫二鉀, 5913.33; 檸檬酸鐵,733.33;乳酸鈣, 8060; 氫氧化鋁, 6.67; 硫酸鋅, 86.67; 硫酸銅, 2.67; 硫酸錳, 20; 碘酸鈣, 6.67; 硫酸鈷, 26.67; b維生素預混料 (mg/kg飼料): β-胡蘿卜素, 32.12; 維生素C, 230; 維生素D3, 3.24; 亞硫酸氫鈉甲萘醌, 15.28; DL-α-維生素E醋酸酯, 12.68; 硝酸硫胺素(B1), 19.24;核黃素(B2), 64.12; 鹽酸維生素B6, 15.28; 維生素B12, 0.04; d-生物素, 1.92; 肌醇, 1283.04; 煙酸, 256.56; 泛酸鈣, 89.34; 葉酸, 4.8; (下表同)

Notes: a Mineral mixture (mg/kg diet): Mg SO4, 3380; Na2HPO4, 2153.33; K2HPO4, 5913.33; Fe Citrate,733.33; Ca Lactate, 8060; Al(OH)3, 6.67; Zn SO4, 86.67; Cu SO4, 2.67; Mn SO4, 20; Ca(IO3)2, 6.67; Co SO4, 26.67; b Vitamin mixture (mg/kgdiet): β-carotene, 32.12; vitamin C, 230; Vitamin D3, 3.24; Menadione Na HSO3. 3H2O (K3), 15.28; DL-α-Tochopherol Acetate (E), 12.68;Thiamine-Nitrate (B1), 19.24; Riboflavin (B2), 64.12; Pyridoxine-HCl (B6), 15.28; Cyanocobalamine (B12), 0.04; d-Biotin, 1.92; Inositol,1283.04; Niacine (Nicotic acid), 256.56; Ca Panthothenate, 89.34; Folic acid, 4.8; (The same below).

2    成蝦實驗用飼料配方及營養組成

Tab. 2    Formula and nutrient composition for adult shrimp experiment (%)

原料Ingredient

0%

2.5%

5%

10%

魚粉 Fish meal

磷蝦粉 Krill meal

豆粕 Soybean meal

糊精Dextrin

α淀粉 α-Starch

魚油 Fish oil

大豆卵磷脂 Soy lecithin

膽固醇 Cholesterol

高筋面粉 Bread flour

維生素混合物 Vitamin mixture

礦物質混合物 Mineral mixture

安定-C35 Stability - C35

氯化膽堿 Choline chloride

檸檬酸鈉 Sodium citrate

琥珀酸鈉 Sodium succinate

氨基葡()糖鹽酸 Glucosamine hydrochloric acid

角叉菜膠 Carrageen glue

腸膜蛋白 Intestinal membrane protein

合計Total

營養水平 Proximate composition

粗蛋白 Crude protein

粗脂肪 Crude lipid

粗灰分 Ash

水分 Moisture

34.00

5.00

20.00

3.00

10.00

2.00

2.00

5.00

5.00

4.00

4.00

0.20

0.60

0.60

0.60

1.00

3.00

0.00

100.00

40.36

6.48

9.85

9.51

31.5

5.00

20.00

3.00

10.00

2.00

2.00

5.00

5.00

4.00

4.00

0.20

0.60

0.60

0.60

1.00

3.00

2.5

100.00

40.48

6.72

9.79

9.46

29.0

5.00

20.00

3.00

10.00

2.00

2.00

5.00

5.00

4.00

4.00

0.20

0.60

0.60

0.60

1.00

3.00

5.0

100.00

40.75

6.85

9.75

9.36

24.0

5.00

20.00

3.00

10.00

2.00

2.00

5.00

5.00

4.00

4.00

0.20

0.60

0.60

0.60

1.00

30

10.0

100.00

40.35

6.59

9.72

9.48

1 材料與方法

1.1 實驗飼料制備

本實驗根據南美白對蝦的營養需求,設計了魚粉含量為41%的幼蝦基礎飼料(0%)和魚粉含量為34%的成蝦基礎飼料(0%)。另外分別配置了腸膜蛋白添加量為2.5%、5%、10%的幼蝦飼料和成蝦飼料,用來替代相應比例的魚粉。四組飼料的其他成分完全相同(表1、表2)。本實驗所用腸膜蛋白為北京中科景明公司的“魚倍壯”產品。飼料原料經粉碎機粉碎,60目篩網過篩后嚴格按飼料配方稱重,逐步進行混勻,隨后加入適量的水,用實驗制粒機制粒,放于通風處晾干,風干后用粉碎機粉碎,分別經20目、40目、60目篩網過篩制成不同規格的飼料,包裝后置于-20℃冰箱保存備用。

1.2 飼養管理

試驗動物為南美白對蝦優質一代蝦苗,實驗分為幼蝦養殖實驗和成蝦養殖實驗,分為四組,每組三個平行。幼蝦養殖實驗養殖周期20天,成蝦養殖實驗養殖周期40天。試驗初始體重為(0.21±0.03) g,放苗密度200/m2。試驗地點為山東省日照市寶祥水產有限公司的工廠化養殖車間,養殖池5 m×5 m,水深1.0-1.2 m。以0%組腸膜蛋白為對照組,2.5%組、5%組和10%組腸膜蛋白為處理組,放養于懸掛在室內水泥池的網箱(1 m×1 m×1 m)中。實驗蝦用基礎飼料馴化7 d后,采用定量投喂。試驗期內,剛開始按照對蝦體重的5%投料,每天喂5次,分別在05:00、09:30、14:00、18:30、23:00,并記錄投喂量、水溫、p H值、鹽度、溶氧等水質參數。投料后,觀察對蝦攝食情況,及時調整投料量。每天觀察對蝦攝食、蛻殼、生長情況。試驗用水為經過沉淀、砂濾的海水,養殖期間每天早上排污并補充新鮮海水。試驗期間連續曝氣充氧,定期測定水中氨氮、亞硝酸鹽含量。試驗期間水溫為 27.0-29.0℃,鹽度為20~25‰,溶解氧>8.0 mg/L,pH值為7.6~8.4,氨氮含量<0.40 mg/L,亞硝酸鹽含量<0.30 mg/L。

1.3 樣品采集

養殖實驗結束前24 h停止投喂,撈取各網箱中的對蝦,稱量其體長和體重并記錄剩余數量,以計算對蝦成活率和增重率。幼蝦實驗每個養殖網箱中隨機撈取南美白對蝦20尾,其中10尾取出肝胰臟后迅速放于液氮中保存,用于測定有關消化酶和免疫酶活性以及肝胰臟中免疫基因proPOPEmRNA的表達情況;10尾蝦用做氨氮脅迫實驗,最終計算氨氮脅迫存活率。成蝦實驗每個養殖網箱中隨機撈取南美白對蝦30尾,其中10尾取出肝胰臟后迅速放于液氮中保存,用于測定有關消化酶活性和免疫基因proPOPEmRNA的表達情況;另外隨機取10尾蝦,抽取血淋巴液,8000 r/min離心20 min,取上清液,于–80℃超低溫冰箱保存,用于血清免疫指標的檢測;剩余的10尾蝦用做氨氮脅迫實驗,計算最終氨氮脅迫存活率。

1.4 營養組成分析

實驗飼料的常規營養分析參照AOAC [14]的方法進行: 水分含量測定采用105℃烘干法, 粗蛋白含量測定采用凱氏定氮法, 粗灰分含量測定用馬福爐550℃灼燒法。實驗飼料和全魚體的全脂肪含量分析參照BlighDyer [15]的方法進行。

1.5 生長指標測定

分別計算幼蝦和成蝦的增重率和特定生長率;統計飼料投喂量,計算飼料轉化率。

增重率(weight gain rate,WGR,%)=100×(Wt-W0)/W0;

特定生長率(specific growth rate,SGR,%/d)=100×[(ln Wt-ln W0)]/t;

飼料轉化率(Feed conversion rate,FCR)=FI/W;

式中:Wt—試驗結束時南美白對蝦的平均重量(g);

W0—試驗開始時南美白對蝦的平均重量(g);

FI—試驗期間蝦攝食飼料的干物質總重量(g);

W—對蝦的增重量(g);

t—養殖時間(d);

1.6 氨氮脅迫存活率

氨氮脅迫實驗開始前,每組取10尾蝦進行預實驗,根據預實驗結果,設置幼蝦的最終氨氮脅迫實驗濃度為70mg/L,成蝦最終氨氮脅迫實驗濃度為80mg/L。實驗時每組取30尾蝦進行實驗,在50×50×50的水盒中進行實驗,試驗期間連續曝氣,每隔12h吸污一次,及時剔除死亡個體,每隔24h換水一次,換水量為100%,并按時監測各試驗液中水溫、pH值。定時觀察白對蝦的活力及存活情況,每隔4h記錄南美白對蝦的死亡尾數。

1.7 血清和肝胰臟相關酶活性檢測

對于幼蝦相關免疫酶和消化酶的測定,均測定其肝胰臟組織。對于成蝦,抽取血淋巴液,4℃離心后取上清測其免疫酶的活性,取肝胰臟組織測其消化酶活性。相關免疫酶和消化酶活性均按照南京建成生物工程研究所所購試劑盒說明書測定。

1.8 免疫基因表達量

將超低溫凍存的南美白對蝦肝胰臟組織按Trizol試劑盒(TaKaRa)說明書提取總RNA。參照Gen Bank公布的南美白對蝦cDNA序列設計proPO(登錄號: JN393011.1 )基因和PE(登錄號:KC708021.1)基因引物及β-actin 內參基因序( 登錄號: JF288784.1) ,由Primer Premier 5.0設計(表3)。采用熒光定量PCR方法檢測,按照上海翊圣反轉錄試劑盒說明書將提取的總RNA先反轉錄為c DNA,再采用SYBRR Green I嵌合熒光法進Real-time PCR反應,反應條件為 95, 10s; 95, 15s; 60, 15s; 40個循環。每個復孔設置參照基因β-actin,根據2ΔΔct計算法進行相對定量后,分析肝胰臟中proPOPE的相對表達量。

1.9 數據處理和統計分析

本實驗結果用平均數±標準差(mean±SD)表示,所有實驗數據均使用SPSS分析軟件中的單因素方差分析(One-Way ANOVA)Duncan氏法多重比較進行差異顯著性分析,P<0.05,

認為差異顯著 。統計結果以平均值±標準差(Mean±SD)的形式表示。

3:熒光定量PCR檢測免疫基因使用的引物序列

Table 3: Primer sequences used for quantitative fluorescence PCR detection of immune genes

目標基因Gene

引物 Primer

序列 Sequence (5′—3′)

ProPO (Prophenoloxidase)

ProPO-F

ProPO-R

TACCTAGTCTTCTTCTTCTACC

TTATGAGTGATGTCGGAGAG

PE (Peroxinectin)

PE-F

PE-R

ACCTGGCTTGACTGCTAT

GCTGGACCGACGATAATG

β-actin (內參)

Actin-F

Actin-R

GCGAGAAGATGACACAGAT

GTGGTCGTGAAGGTGTAG

2 結果

2.1 幼蝦生長性能

腸膜蛋白添加對南美白對蝦生長性能的影響見表4,可以看出喂養20d的幼蝦,隨著腸膜蛋白添加量的增加,對蝦的末體重、增重率、特定生長率呈現先上升后下降的趨勢;飼料轉化率呈現先下降后上升的趨勢。當腸膜蛋白添加量為10%時,對0%組相比對蝦的末體重、增重率、特定生長率、飼料轉化率均沒有明顯變化。其中末體重、增重率、特定生長率最高的為5%組,顯著高于其余各組(P<0.05);飼料轉化率最低的為5%組,顯著低于其余各組(P<0.05)。

4:飼料添加腸膜蛋白對南美白對蝦幼蝦生長性能的影響

Table 4: Growth performance of juvenile vannamei shrimp after 20 day feeding 

添加量

Add the amount

初始體重

IBW(g)

末體重

FBW(g)

增重率

WG(%)

特定生長率

SGR(%/d)

飼料轉化率

FCR(%)

存活率

SR (%)

0%

0.21±0.01

1.10±0.01c

417.70±8.74c

8.22±0.08c

1.45±0.01a

94.67±0.01

2.5%

0.21±0.01

1.32±0.02b

522.33±13.43b

9.14±0.11b

1.26±0.01b

96.00±0.01

5%

0.21±0.01

1.41±0.02a

566.12±9.86a

9.48±0.07a

1.16±0.01c

94.50±0.02

10%

0.21±0.01

1.12±0.02c

421.52±2.73c

8.26±0.03c

1.42±0.01a

94.50±0.01

注:統計結果以平均值±標準差(Mean±SD)的形式表示, 每組3個平行; 同列數字肩標相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05), 不同小寫字母表示差異顯著(P?0.05)。下表同

Note: Values were expressed as mean ± standard deviation (SD) of three experiments in each group; the Numbers shoulder the same letters within the same column or no letter indicates no significant difference (P > 0.05), different small letters mean significant difference (P ? 0.05).The following table

2.2 幼蝦相關免疫酶和消化酶活性

添加腸膜蛋白對幼蝦相關免疫酶的影響如圖1,可以看出喂養20d的幼蝦肝胰臟堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性隨腸膜蛋白水平的增加呈先升高后降低的變化趨勢,且在 5%組達到最高,顯著高于其余各組 (P 0.05);腸膜蛋白水平對酸性磷酸酶和溶菌酶的活性沒有顯著影響,但酸性磷酸酶活性在5%組的高于其余各組。添加腸膜蛋白對幼蝦相關消化酶的影響如圖2,可以看出喂養20d的幼蝦肝脂肪酶活性隨腸膜蛋白水平的增加呈先升高后降低的變化趨勢,且在5%組達到最高,顯著高于其余各組 (P 0.05)。此外飼料腸膜蛋白水平對胰蛋白酶和淀粉酶的活性沒有明顯影響。

1:腸膜蛋白對南美白對蝦幼蝦肝胰臟免疫酶指標的影響(ACP:酸性磷酸酶;AKP:堿性磷酸酶;SOD:總超氧化物歧化酶;LZM:溶菌酶。)

Figure 1: Hepatopancreatic immune enzyme index in juvenile vannamei shrimp after 20 day feeding (ACP: acid phosphatase; AKP: alkaline phosphatase; SOD: total superoxide dismutase; LZM: lysozyme.)

注:相同小寫字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母表示差異顯著(P?0.05)。下圖同

Note: The same lowercase letters or no letter indicates no significant difference (P > 0.05), different small letters mean significant difference (P ? 0.05).The figure below

Data 1

2:腸膜蛋白添加對南美白對蝦幼蝦肝胰臟消化酶指標的影響PRS:胰蛋白酶;AMS:淀粉酶;LPS:脂肪酶)

Figure 2: Hepatopancreatic digestive enzyme index of juvenile vannamei shrimp after 20 day feeding (PRS: trypsin; AMS: amylase; LPS: lipase)

2.3 幼蝦氨氮耐受性

氨氮脅迫實驗對南美白對蝦存活率的影響如圖3,由圖3可以看出喂養20d的幼蝦氨氮脅迫48h存活率隨著飼料腸膜蛋白水平的增加呈先升高后降低的變化趨勢,當腸膜蛋白添加量為5%時氨氮脅迫存活率最高,明顯高于其余各組;腸膜蛋白添加量為10%時,氨氮脅迫48h存活率與對照組相比沒有明顯差異。

Data 1

3:飼料添加腸膜蛋白對南美白對蝦幼蝦氨氮脅迫存活率的影響

Figure 3: Survival rate of juvenile vannamei shrimp expose to ammonia water

2.4 幼蝦肝胰臟免疫相關基因表達

喂養20d的幼蝦肝胰臟中酚氧化酶(proPO)的表達量與對照組相比,隨著腸膜蛋白水平的增加呈先升高后降低的變化趨勢,當腸膜蛋白量為5%時表達量最高,顯著高于其余各組(P<0.05);細胞黏附蛋白(PE)的表達量表達量隨著腸膜蛋白水平的增加呈升高趨勢,與對照組相比2.5%組沒有顯著性差異,5%10%組顯著升高(P<0.05)。(圖4

Data 1

4:飼料添加腸膜蛋白對南美白對蝦幼蝦肝胰臟免疫相關基因的影響

Figure 4: Hepatopancreatic immune-related genes in juvenile vannamei shrimp after 20 day feeding

2.5 成蝦生長性能

喂養40d的成蝦生長性能見表5,在初始體重一樣的情況下,與對照組相比,對蝦的末體重、增重率、特定生長率隨著腸膜蛋白水平的增加呈先升高后降低的變化趨勢,且均在5%組達到最大,顯著高于其余各組(P<0.05);在飼料轉化率上,添加量為2.5%組和5%組顯著低于0%組和10%(P<0.05),其中5%最低,顯著低于其余各組(P<0.05);0%組和10組沒有明顯差異。

5:飼料添加腸膜蛋白對南美白對蝦成蝦生長性能的影響

Table 5: Growth performance of adult vannamei shrimp after 40 days feeding

添加量

Add the amount

末體重

FBW(g)

末體重

FBW(g)

增重率

WG(%)

特定生長率

SGR(%/d)

飼料轉化率

FCR(%)

存活率

SR (%)

0%

4.20±0.05c

4.20±0.05c

1884.01±47.23b

7.47±0.06b

1.29±0.02a

94.67±0.01

2.5%

4.36±0.03b

4.36±0.03b

1955.83±45.18b

7.56±0.04b

1.24±0.01b

96.00±0.01

5%

4.74±0.03a

4.74±0.03a

2137.37±42.80a

7.77±0.03a

1.13±0.01c

94.50±0.02

10%

4.27±0.03c

4.27±0.03c

1890.48±94.12b

7.48±0.05b

1.27±0.01a

94.50±0.01

2.6 成蝦血清相關免疫酶活性和肝胰臟消化酶活性

與對照組相比,喂養40d的成蝦血清中酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶活性均隨著腸膜蛋白水平的增加呈先升高后降低的變化趨勢,其中酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶活性在5%組達到最高,顯著高于其余各組(P<0.05);堿性磷酸酶活性在2.5%組達到最高,顯著高于5%組和10%(P<0.05)(圖5)。添加腸膜蛋白對成蝦肝胰臟消化酶的影響見圖6,可以看出喂養40d的成蝦肝胰臟脂肪酶活性隨著腸膜蛋白添加量的增加呈先升高后降低的變化趨勢,且均在5%組最大,顯著高于0%、2.5%10%(P<0.05),此外飼料腸膜蛋白水平對肝胰臟胰蛋白酶和淀粉酶活性沒有明顯的影響。

Data 1

5:腸膜蛋白對南美白對蝦成蝦血清免疫酶指標的影響

Figure 5: Serum immune enzyme activities of adult vannamei shrimp after 4 days feeding

Data 1

6:腸膜蛋白對南美白對蝦成蝦肝胰臟消化酶指標的影響

Figure 6: Hepatopancreatic digestive activities of adult vannamei shrimp after 4 days feeding

2.7 成蝦氨氮脅迫

腸膜蛋白對成蝦氨氮脅迫的影響見圖7,可以看出喂養40d的成蝦氨氮脅迫48h存活率隨著腸膜蛋白添加量的增加呈現先上升后下降的趨勢,5%組的存活率明顯高于0%、2.5%10%組,其余各組存活率沒有明顯的差異。

Data 1

7:飼料添加腸膜蛋白對南美白對蝦成蝦氨氮脅迫存活率的影響

Figure 7: Survival rate of adult vannamei shrimp after 4 days feeding expose to ammonia water

2.8 成蝦肝胰臟免疫相關基因表達

在喂養40d的成蝦肝胰臟中,酚氧化酶(proPO)的表達量隨著腸膜蛋白添加量的增加呈先上升后下降的趨勢(圖8),其中2.5%組和5%最高,顯著高于0%組和10%(P<0.05);細胞黏附蛋白(PE)的表達量隨著腸膜蛋白水平的增加略有升高,但0%組、2.5%組和5%組沒有顯著性差異,在10%組中顯著降低(P<0.05)。

Data 1

8:飼料添加腸膜蛋白對南美白對蝦成蝦肝胰臟免疫相關基因的影響

Figure 8: The gene expressions of hepatopancreatic immune-related genes in vannamei shrimp

3 討論

在哺乳動物研究,霍寶占[16]研究發現,仔豬斷奶后飼喂腸膜蛋白粉能顯著降低料肉比,同時還證實仔豬日糧中的腸膜蛋白粉均可改善斷奶仔豬的生產性能。徐軍等[17]研究表明在斷奶仔豬日糧中添加腸膜蛋白粉3%6%效果較好,平均日采食量、平均日增重顯著提高,過高或過低都會降低其效果。本實驗結果也顯示,在幼蝦飼料中腸膜蛋白添加量為2.5%5%時都可顯著增強其生長性能,降低其飼料轉化率。這表明腸膜蛋白在南美白對蝦飼料中具有促進生長的作用。而當添加量增加為10%時,與對照組相比生長性能沒有明顯變化,這可能是飼料中腸膜蛋白含量過高可能引起了飼料中氨基酸的不平衡,導致幼蝦對飼料利用率的降低,影響其正常生長。類似結果在Myer[8]等和Cho[18]等關于豬飼料中腸膜蛋白添加量的研究中也有所報道。

高欣等[2]研究結果表明,添加腸膜蛋白能明顯提高斷奶仔豬生長性能和降低腹瀉指數,且有提高消化道酶活性的趨勢。甲殼動物消化酶的活性與其食性、發育階段、營養、溫度、pH值、鹽度等諸因素密切相關,并同時受到內因和外因的調控[19]。本實驗結果表明飼料中添加腸膜蛋白可以增強部分消化酶活性,在幼蝦結果中,飼料中添加腸膜蛋白對其脂肪酶和胰蛋白酶的活性有顯著性增強。這說明飼料中添加腸膜蛋白可以顯著提高南美白對蝦部分消化酶的活性,有利于其快速生長。這可能是由于腸膜蛋白含有較多有利于消化吸收的生物因子,更有利于對蝦的消化吸收。在成蝦實驗結果中腸膜蛋白添加量為5%組的淀粉酶和脂肪酶活力顯著高于0%、2.5%10%(P<0.05);2.5%5%組的胰蛋白酶活力顯著高于0%10%(P<0.05)。這和幼蝦實驗結果有所不同,原因可能是由于在成蝦的養殖過程中,每天的攝食量比幼蝦更多,養殖時間更長,腸膜蛋白對成蝦的影響更加顯著。同時也說明腸膜蛋白的添加可以增強南美白對蝦肝胰臟部分消化酶的活性。

腸膜蛋白粉富含短鏈肽和平衡的氨基酸,而短鏈肽和游離氨基酸具有較高的生物學活性,能夠增強動物特別是幼齡動物的生產性能和免疫功能,以及減少動物采食植物性或動物性異源大分子蛋白而出現的腸道免疫應激[20]。要秀兵等[10]研究發現,腸膜蛋白粉能夠促進淋巴細胞增殖,有利于斷奶仔豬免疫能力的提高。與脊椎動物不同,甲殼動物免疫系統以非特異性免疫為主,體液中不含有免疫球蛋白,無抗體介導的免疫反應,體液免疫反應主要依靠血液淋巴中的一些酶[21]。酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶 (AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LZM)是反映對蝦免疫能力的重要指標,在對蝦防御反應中具有非常重要的作用。在本實驗中,幼蝦結果表明,飼料中添加腸膜蛋白可以使對蝦體內堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶活力顯著升高;酸性磷酸酶(ACP)和溶菌酶(LZM的活性也有所升高但沒有顯著性差異。這是由于腸膜蛋白生物利用率高,可以提高動物抗病性,增強免疫力。同樣的在成蝦實驗中,5%組的酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶活力顯著高于0%、2.5%10%(P<0.05);2.5%5%組的堿性磷酸酶活力顯著高于0%10%(P<0.05)。這同樣說明腸膜蛋白的添加增強可以南美白對蝦部分免疫酶活性,其在成蝦中比幼蝦更加明顯。但在本實驗中當腸膜蛋白添加量過高時則會導致其相關免疫酶活性下降。

在夏季高溫時,南美白對蝦養殖水體中容易積累較高濃度的氨氮和亞硝酸氮,從而造成對蝦死亡。關于腸膜蛋白對水產動物氨氮耐受性的研究鮮有報道,因此在本實驗對南美白對蝦的氨氮耐受性進行了研究,以確定腸膜蛋白的添加對南美白對蝦耐氨氮能力的影響。本實驗幼蝦結果顯示,腸膜蛋白的適當添加可以提高南美白對蝦幼蝦的氨氮耐受性,最適合的添加量為5%,這可能是由于適量的腸膜蛋白添加增強了南美白對蝦自身的環境適應能力和抗應激能力。同樣的,在成蝦實驗中,結果與幼蝦一致,腸膜蛋白添加量為5%組的氨氮脅迫48h存活率明顯高于0%、2.5%10%組。這些結果表明了適量的腸膜蛋白添加可促進南美白對蝦的耐受能力。

酚氧化酶(proPO)是一種含銅的氧化還原酶,其反應鏈的短暫中間產物擁有很高的生物毒性,能夠抑制病原體胞外蛋白酶以及幾丁質酶的活性,屬于一種酶級聯反應系統,在南美白對蝦抵抗病原菌侵襲過程中具有重要作用[22]。細胞黏附蛋白(PE)是一種重要的細胞黏附蛋白,其生物活性伴隨著proPO系統的激活而活化,同時還具有調理素活性、促包囊形成和過氧化物酶的活性等[23]。在幼蝦實驗中,結果表明隨著腸膜蛋白添加量的增加proPO PE的表達量隨之增加,當添加量為5%proPO的表達量達到最高,當添加量為10%proPO的表達量下降。有所不同的是,在成蝦實驗中,腸膜蛋白添加量為2.5%、5%組的ProPO表達量顯著高于0%、和10%(P<0.05);0%、2.5%、5%組的PE表達量顯著高于10%(P<0.05)。這表明腸膜蛋白的添加可以增強南美白對蝦肝胰臟免疫相關基因的表達量,并且在幼蝦和成蝦中有所差異。這可能是由于幼蝦和成蝦機體的差異性導致,具體的影響機制有待進一步的研究。

綜上所述,在南美白對蝦幼蝦和成蝦飼料中添加腸膜蛋白替代魚粉用量5%,可以顯著提高南美白對蝦的增重率、特定生長率,促進南美白對蝦的生長,降低飼料轉化率,同時提高了南美白對蝦肝胰臟部分消化酶的活力、血清免疫指標和耐氨氮能力。同時生產實際中添加腸膜蛋白替代部分魚粉,可大大降低飼料配方成本,緩解魚粉資源的不足,提升飼料使用效果。因此,腸膜蛋白作為魚粉替代物及添加物在南美白對蝦飼料中具有良好的添加效果,其添加量建議為5%。

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Effects of intestinal membrane protein supplementation on growth performance, digestion, immunity and stress response in penaeus praeus

YANG Chuang1, XU xuexin, JIANG sheng, LI Zhen3, CAO Xiaojuan1, 2, GAO Jian1, 2

(1 College of Fisheries, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China;

2 Beijing Zhongke Jingming Biotechnology Co. Ltd., Beijing 100193;

3 China National Aquaculture Experimental Teaching Demonstration Center; Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China;)

Abstract: This study was designed to investigate the effects of dietary intestinal membrane protein (IMP) levels on growth performance, feed utilization, antioxidant capacity and immune response in vinnamei shrimp. Four isonitrogenous and isolipidic experimental diets were formulated to contain 0%, 2.5%, 5%, and 10% IMP. Each diet was fed to triplicate groups of shrimp (0.21±0.01g) for 20 and 40 days. For 20 days, the results showed that the weight gain rate and specific growth rate of juvenile shrimp in the 5% group were significantly higher than those in other groups (P<0.05). The enzyme activities of alkaline phosphatase, total superoxide dismutase, lipase and trypsin in the 5% group were significantly higher than those in the other groups (P<0.05). Under the condition of ammonia-nitrogen stress, the survival rate increases first and then decreases with the increase of substitution amount. The ProPO and PE expression levels in the liver and pancreas of the intestinal membrane protein group were significantly higher than those of the control group (P<0.05). For 40 day feeding, the results showed that the final weight, weight gain rate and specific growth rate of the 5% group were significantly higher than those of the other groups (P<0.05). The activities of acid phosphatase, total superoxide dismutase, lysozyme, amylase and lipase were the highest in the 5% group (P<0.05). The survival rate under ammonia stress in the 5% group was higher than that in the 0%, 2.5% and 10% groups. The ProPO and PE expression levels in the 5% group were significantly higher than those in the 0%, 2.5% and 10% groups (P<0.05). In conclusion, dietary 5% IMP supplementation could improve growth performance, digestion, immunity in vinnamei shrimp.

Keywords: Vannamei shrimp; Intestinal membrane protein; Growth performance; Antioxidant.



投稿日期:201964

基金項目:

作者簡介: 楊闖(1993), , 河南駐馬店人; 研究方向為魚類營養與生理。E-mail: 1280346463@qq.com

通訊作者:高堅,E-mailgaojian@mail.hzau.edu.cn


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